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Übersicht

Absorptions- und kolorimetrische Assays dienen dem Nachweis oder der Quantifizierung der Menge eines bestimmten Reagens in einem Assay durch Messung der vom Reagens oder chromogenen Reaktionsprodukt bei einer charakteristischen Wellenlänge absorbierten Lichtmenge. Diese Wellenlänge ist spezifisch für das zu messende Reagenz. Je größer die Menge des Reagenzes in der Vertiefung ist, desto mehr Licht wird absorbiert. Viele kolorimetrische Assays verwenden ein „chromogenes“ (farbgebendes) Substrat, das bei der Umwandlung in sein Endprodukt Licht bei einer bestimmten Wellenlänge absorbiert.

Beispiele für Absorptionstests sind kolorimetrische ELISAs (wie der Alliance p24-Kit), ELAST ELISA, Tests, die chromogene Substrate verwenden (wie BCIP, DAB, 4CN und Fast Red), Bradford-Tests, Tests zur Quantifizierung auf der Grundlage des molaren Extinktionskoeffizienten einer Substanz und andere Absorptions- und kolorimetrische Tests.

Kolorimetrisches ELISA-Verfahren
Beispiel für ein kolorimetrisches ELISA-Verfahren.

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Überlegungen zur Platte

Absorptionswellenlänge und spektrale Eigenschaften der Platte

Assays, die die Absorption im sichtbaren Lichtbereich (400-900 nm Wellenlänge) messen, können in Polystyrolplatten mit klarem Boden durchgeführt werden. Für Tests, die die Absorption im ultravioletten Bereich (200-400 nm Wellenlänge) messen, werden Platten aus einem UV-transparenten Material (wie Glas oder Cyclic Olefin Copolymers) benötigt, um die Absorption von Licht durch den Kunststoff selbst zu vermeiden.

Signal

Die meisten Absorptions- (kolorimetrischen) Tests werden in durchsichtigen Platten, wie SpectraPlate™-Mikroplatten, durchgeführt. Der Grund dafür ist, dass die klare Farbe des Kunststoffs die Messungen im Bereich des sichtbaren Lichts (Wellenlängen von 400-900 nm) nicht stören sollte. Klarer Polystyrol-Kunststoff sollte kein Licht im sichtbaren Bereich absorbieren.

Übersprechen

Übersprechen tritt auf, wenn die Absorption von einer benachbarten Vertiefung die Messung der interessierenden Vertiefung stört, und kann manchmal bei Plattenformaten mit höherer Dichte (384-Well, 1536-Well) problematisch sein. Die Verwendung von Platten mit klarem Boden und weißen Wellwänden (wie IsoPlate™- und ViewPlate®-Mikroplatten) kann hilfreich sein, wenn Übersprechen ein Problem darstellt.

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Mikroplatten für zellbasierte Absorptionsassays

Die Wahl der richtigen Mikroplatte für einen zellbasierten Assay hängt sowohl von der spezifischen Zelllinie ab, die im Assay verwendet wird, als auch vom Assayprotokoll selbst. Zu den Fragen, die bei der Auswahl der Platte beantwortet werden müssen, gehören:

  1. Brauche ich eine sterile, mit Gewebekultur behandelte Platte?
  2. Muss die Platte beschichtet sein?
  3. Sollte die Platte einen klaren oder undurchsichtigen Boden haben?

Überlegungen zur Platte
Ob es notwendig ist, eine sterile, mit Gewebekulturen behandelte Platte zu verwenden, hängt davon ab, wie lange sich die Zellen in der Testplatte befinden werden. Bei einigen Tests werden die Zellen in die Mikrotiterplatte gegeben und der Test ist innerhalb weniger Minuten bis Stunden abgeschlossen. In anderen Fällen werden die Zellen vor der Durchführung des Assays mindestens über Nacht in den Platten gezüchtet oder über einen längeren Zeitraum mit Verbindungen behandelt. Als allgemeine Empfehlung gilt, dass eine sterile, mit Gewebekulturen behandelte Platte nicht erforderlich ist, wenn der Assay innerhalb eines einzigen Arbeitstages durchgeführt werden soll. Wenn die Zellen über Nacht oder länger in der Platte verbleiben, sollte eine sterile, mit Gewebekulturen behandelte Platte verwendet werden, und es sollten aseptische Techniken angewandt werden.

Die Notwendigkeit von mit Gewebekulturen behandelten oder beschichteten Platten hängt von den spezifischen Zelllinien ab, die verwendet werden, und davon, wie die Zellen im Laufe des Assays behandelt werden sollen. Zellen können grob in drei Zellklassen eingeteilt werden:

  1. Stark adhärente Zellen
  2. Schwach adhärente Zellen
  3. Suspensions- oder nicht adhärente Zellen

Unsere sterilen Mikroplatten sind alle mit Gewebekultur behandelt, um die Zellanhaftung und das Wachstum zu fördern. Bei der Gewebekulturbehandlung wird eine Polystyrol-Mikroplatte einem Plasmagas ausgesetzt, um die hydrophobe Kunststoffoberfläche zu verändern und hydrophiler zu machen. Die so entstandene Oberfläche ist aufgrund des Vorhandenseins von sauerstoffhaltigen funktionellen Gruppen wie Hydroxyl- und Carboxylgruppen netto negativ geladen. Stark haftende Zellen haften in der Regel zufriedenstellend an den mit Gewebekultur behandelten Platten. Zelllinien, die weniger stark anhaften, benötigen möglicherweise eine Platte mit einer Beschichtung wie Poly-D-Lysin oder Kollagen, die das Anhaften besser fördert als eine reine Gewebekulturbehandlung. Zellbasierte Assays mit Suspensionszellen werden im Allgemeinen in standardmäßigen, mit Gewebekultur behandelten Platten durchgeführt. Beschichtete Platten werden in der Regel nicht für Suspensionszellen verwendet.

Neben der spezifischen Zelllinie, die in dem Assay verwendet wird, ist auch das Assay-Protokoll selbst wichtig für die Entscheidung, welche Art von Platte zu verwenden ist. Zum Beispiel können Assays mit adhärenten Zellen einen Wechsel des Kulturmediums oder Waschschritte im Protokoll beinhalten. In solchen Fällen kann es ratsam sein, eine beschichtete Platte für den Assay zu verwenden, um zu verhindern, dass sich die Zellen während des Assays von der Platte lösen.

Siehe zusätzliche Informationen über Plattenbehandlungen und Beschichtungen.

Klarer Boden vs. undurchsichtige Platten
Mikrotiterplatten mit durchsichtigen Böden können für zellbasierte Assays nützlich sein, da sie die mikroskopische Visualisierung der Zellen ermöglichen, um Konfluenz, Morphologie und andere Parameter zu überwachen, die die zelluläre Reaktion im Assay beeinflussen können. Darüber hinaus erfordern Assays, die für das Ablesen des Bodens konfiguriert sind, Platten mit klarem Boden.

Platten mit klarem Boden können durch Anbringen eines BackSeal in funktionell undurchsichtige Platten umgewandelt werden. BackSeals sind entweder in weiß oder schwarz erhältlich (Katalognummer 6005199 für weiß, Katalognummer 6005189 für schwarz). Die Farbe des BackSeals sollte mit der Farbe der Seiten der Plattenvertiefungen übereinstimmen.

SpectraPlate™ TC clear microplates
Nicht alle SpectraPlate-Mikroplatten sind steril/gewebekulturbehandelt. Achten Sie bei zellbasierten Assays mit adhärenten oder Suspensionszellen auf SpectraPlate-Produkte, die mit „TC“ (tissue culture-treated) gekennzeichnet sind. SpectraPlate-Mikrotiterplatten sind völlig transparent und haben keine Farbe. Der durchsichtige Boden ermöglicht eine mikroskopische Visualisierung, was hilfreich sein kann, wenn eine mikroskopische Beobachtung zur Überprüfung der Zelldichte und -morphologie erforderlich ist. Der durchsichtige Boden der Platte ermöglicht auch Messungen von oben oder unten. Diese Platten werden sowohl im 96-Well- als auch im 384-Well-Format angeboten.

Auswahltabelle für zellbasierte Absorptions- und kolorimetrische Assays
Platte
Beschreibung
SpectraPlate™
  • Angeboten in Gewebekultur-behandelten
  • Klarsichtplatten
  • Plattenlesegeräte für die Ablesung von oben oder unten
  • Erhältlich in 96-Well, 384-Well- und 1536-Well-Formaten

Tipps und FAQ

Q. Welche Arten von Deckeln kann ich für meine Platten verwenden?
A. TC-behandelte SpectraPlates, wie auch alle TC-behandelten Mikroplatten von PerkinElmer, werden mit einem Deckel geliefert. Die Ausnahme ist, wenn die TC-kulturbehandelte Platte in einer Kiste mit 200 Stück gekauft wird. In diesem Fall werden die Deckel nicht mit den Mikrotestplatten geliefert und müssen separat erworben werden. Für 96-Well-Platten lautet die Katalognummer für den Deckel 6005619, für 384-Well- und 1536-Well-Platten 6007619. Deckel für 96-Well-Platten haben Kondensationsringe, die mit den darunter liegenden Vertiefungen fluchten. Diese Deckel lassen einen kleinen Zwischenraum zwischen dem Deckel und dem Well. Dies ist notwendig, damit die Zellen während des Wachstums „atmen“ können. Die Deckel sollten vor dem Ablesen der Platte entfernt werden, um eine Beschädigung des Plattenlesegeräts zu vermeiden.

Q. Kann ich meine Platten versiegeln, oder werden dadurch meine Zellen getötet?
A. Wenn die Lebensfähigkeit der Zellen kein Thema mehr ist, kann die TopSeal-A™-Klebeplattenversiegelung, Katalognummer 6050185, verwendet werden, um die Verdunstung während der Inkubationsschritte zu verhindern. Der Kunststoff der TopSeal-A-Klebeversiegelung hat einige spektrale Eigenschaften, die mit Assays, die bei Absorptionswellenlängen durchgeführt werden, interferieren können. Es kann erforderlich sein, das Siegel vor dem Ablesen von der Platte zu entfernen. Wenn die Lebensfähigkeit der Zellen zu dem Zeitpunkt, an dem eine Versiegelung benötigt wird, ein Problem darstellt, empfehlen wir die Verwendung von sterilen Plattendeckeln (wenn sterile Praktiken beibehalten werden müssen) oder atmungsaktiven Plattensiegeln (wenn den Kulturmedien Antibiotika/Antimykotika zugesetzt werden können, um eine Kontamination zu verhindern). Atmungsaktive Plattendichtungen sind von verschiedenen Anbietern erhältlich, darunter Nunc® und Corning®.

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Mikroplatten für biochemische Absorptionstests

Mikroplatten für standardmäßige In-vitro-Absorptions-/Farbmetrik-Tests, die keine Verankerung von Zellen oder anderen Reagenzien auf der Plattenoberfläche erfordern.

SpectraPlate-Mikroplatten
SpectraPlate-Platten sind vollständig transparent. Der durchsichtige Boden ermöglicht Messungen von oben oder unten. Diese Platten werden in den Formaten 96-Well, 384-Well (Standard oder shallow well) und 1536-Well angeboten.

ViewPlate™- und IsoPlate™-Mikroplatten
In Fällen, in denen Übersprechen ein Problem darstellen kann (insbesondere in den Formaten 384-Well oder 1536-Well mit höherer Dichte), können ViewPlate- oder IsoPlate-Mikroplatten mit weißwandigen Seiten getestet werden. Diese Platten werden mit einem durchsichtigen Boden angeboten, wobei die Seiten jeder Vertiefung eine durchgängig weiße (oder schwarze) Farbe haben.

Auswahltabelle biochemische Absorption und kolorimetrischer Assay
Platte
Beschreibung
SpectraPlate™
  • Klare Platte
  • Top- oder von unten lesende Plattenlesegeräte
  • Erhältlich in 96-Well, 384-Well, und 1536-Well-Formaten
ViewPlate™
  • Klare Bodenplatte mit weißen Seiten
  • Kann getestet werden, um das Übersprechen bei Verwendung von 384-Wells und 1536-Well-Formaten getestet werden
  • Für Bottom-Reader (bei Verwendung eines Top-Readers wird empfohlen, ein BackSeal hinzuzufügen)
  • Erhältlich in 96-Well, 384-Well, und 1536-Well-Formaten
IsoPlate™
  • Platte mit klarem Boden und weißen Seiten
  • Für Bottom-Reading-Plattenleser (bei Verwendung eines Top-Reading(bei Verwendung eines von oben ablesbaren Geräts wird empfohlen, ein BackSeal hinzuzufügen)
  • Nur im 96-Well-Format erhältlich

Die IsoPlate-Mikroplatten mit klarem Boden ähneln den ViewPlate-Mikroplatten, da der Boden der Platte klar ist, während die Seiten der einzelnen Vertiefungen entweder schwarz oder weiß sind. Dadurch ist die IsoPlate-Mikroplatte für Bodenlesegeräte geeignet. Es gibt jedoch einige Unterschiede zwischen IsoPlate- und ViewPlate-Mikroplatten. Bei der Herstellung von IsoPlates werden zunächst 96 durchsichtige Vertiefungen geformt und dann ein schwarzer oder weißer Rahmen um die durchsichtigen Vertiefungen gegossen. Dadurch erstreckt sich die weiße oder schwarze Vertiefung bis zur gleichen Tiefe wie der Boden der klaren Vertiefung und kann dazu beitragen, das Übersprechen bei Bottom-Reading-Assays zu reduzieren. IsoPlates wurden ursprünglich für die Koinzidenzzählung in einem radiometrischen MicroBeta®-Detektionsgerät entwickelt (gleichzeitige Messung von oben und unten). Obwohl sie klare Böden haben, sind IsoPlates nicht ideal für die konfokale Bildgebung (mikroskopische Beobachtungen), da die optische Klarheit des Bodens nicht so gut ist wie bei CellCarrier™ Ultra oder ViewPlate-Mikroplatten.

Tipps und FAQ

Q. Welche Art von Plattensiegel kann ich für meine Platten verwenden?
A. Die selbstklebende Plattenversiegelung TopSeal-A, Katalognummer 6050185, kann verwendet werden, um die Verdunstung während der Inkubationsschritte zu verhindern. Der Kunststoff der TopSeal-A-Klebeversiegelung hat einige spektrale Eigenschaften, die bei Assays, die bei bestimmten Absorptionswellenlängen durchgeführt werden, störend wirken können. Es kann notwendig sein, das Siegel vor dem Ablesen von der Platte zu entfernen.

Q. Welche Arten von Deckeln kann ich für meine Platten verwenden?
A. Klare, unsterile Deckel, die auf unsere SpectraPlate- und ViewPlate-Mikroplatten passen, können separat bestellt werden (Katalognummer 6005617 für 96-Well-Platten, Katalognummer 6007617 für 384-Well- oder 1536-Well-Platten). Diese Deckel lassen einen kleinen Zwischenraum zwischen dem Deckel und der Vertiefung, was über längere Zeiträume zu Verdunstung führen kann. Die Deckel sollten vor dem Ablesen der Platte entfernt werden, um eine Beschädigung des Plattenlesegeräts zu vermeiden.

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Mikroplatten für Coated-Plate-Assays (einschließlich kolorimetrischer ELISAs)

Gelegentlich als „Festphasen-Assays“ bezeichnet, erfordern Coated-Plate-Assays die Verankerung einer der Assay-Komponenten (Protein, Antikörper, Probe, etc.) auf der Oberfläche der Mikroplatte. Bei Assays mit beschichteten Platten werden Waschschritte verwendet, um gebundene (assoziierende) und ungebundene (nicht assoziierende) Reagenzien von den Vertiefungen der Platte zu trennen.

SpectraPlate HB-Mikroplatten
SpectraPlate-Mikroplatten mit hoher Bindung sind unbeschichtete Platten, die speziell behandelt wurden, um eine passive, direkte Beschichtung von Antikörpern, Proteinen, Proben und anderen Biomolekülen mit Standardplattenbeschichtungsverfahren zu ermöglichen. Diese Platten sind vollständig transparent. Der durchsichtige Boden ermöglicht Messungen von oben oder unten. Diese Platten werden im 96-Well- und 384-Well-Format angeboten.

Auswahltabelle für kolorimetrische Assays mit beschichteten Platten
Platte
Beschreibung
SpectraPlate™ HB
  • High-Bindungsbehandlung für direkte Plattenbeschichtungsprotokolle
  • Klare Platte
  • Oben oder unten lesende Plattenlesegeräte
  • Erhältlich in 96-Well- und 384-Well-Formaten

Tipps und FAQ

Q. Welche Art von Plattensiegel kann ich für meine Platten verwenden?
A. Die selbstklebende Plattenversiegelung TopSeal-A, Katalognummer 6050185, kann verwendet werden, um die Verdunstung während der Inkubationsschritte zu verhindern. Der Kunststoff der TopSeal-A-Klebeversiegelung hat einige spektrale Eigenschaften, die bei Assays, die bei bestimmten Absorptionswellenlängen durchgeführt werden, störend wirken können. Es kann notwendig sein, das Siegel vor dem Ablesen von der Platte zu entfernen.

Q. Welche Arten von Deckeln kann ich für meine Platten verwenden?
A. Klare, unsterile Deckel, die auf unsere SpectraPlate-Mikroplatten passen, können separat bestellt werden (Katalognummer 6005617 für 96-Well-Platten, Katalognummer 6007617 für 384-Well-Platten). Bei diesen Deckeln verbleibt ein kleiner Zwischenraum zwischen dem Deckel und der Vertiefung, der mit der Zeit zu Verdunstung führen kann. Die Deckel sollten vor dem Ablesen der Platte entfernt werden, um Schäden am Plattenlesegerät zu vermeiden.

Q. Haben Sie irgendwelche Vorschläge für Plattenbeschichtungsprotokolle, die ich verwenden kann, um meine Antikörper/Proben an die Platte zu binden?
A. Platten mit hohem Bindungsgrad können mit jeder Standardmethode für die Plattenbeschichtung beschichtet werden. Die Platten können passiv beschichtet werden, wobei die folgenden Grundregeln zu beachten sind:

  1. Antikörper, Protein oder Probe (Konzentration von ~10 µg/ml oder höher) werden über Nacht in der Platte in einem Karbonatpuffer bei einer geeigneten Temperatur (Raumtemperatur oder 4 °C) inkubiert. Wählen Sie eine Temperatur, die dazu beiträgt, die Stabilität des beschichteten Antikörpers, Proteins oder der Probe aufrechtzuerhalten.
  2. Die Platte wird dreimal mit Puffer (z. B. 1X PBS) gewaschen.
  3. Die Platte wird über Nacht „blockiert“, um die verbleibende Oberfläche der Vertiefungen zu bedecken (in der Regel unter Verwendung von BSA, Zuckern wie Trehalose oder Kasein, Serum usw.)
  4. Endgültige Waschungen werden mit Puffer durchgeführt, bevor die Platte in einem Assay verwendet wird.

Für weitere Informationen zur Plattenbeschichtung, Blockierung und Lagerung empfehlen wir diese Referenz:

Brown, M. C. (2011) Microtiter Plate Elisa, in Immunoassays in Agricultural Biotechnology (ed G. Shan), John Wiley & Sons, Inc, Hoboken, NJ, USA. doi: 10.1002/9780470909935.ch4

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Plattenverschlüsse

PerkinElmer bietet eine Vielzahl von Plattenverschlüssen an. TopSeal™ ist eine Reihe von Plattensiegeln, die auf die Oberseite der Platte aufgebracht werden und dazu dienen, Verdunstung oder radioaktive Kontamination während der Assay-Inkubationsschritte und/oder der Plattenablesemessungen zu verhindern. TopSeal-A kann während Lumineszenz-, AlphaScreen®-, AlphaLISA®-, AlphaLISA®SureFire® Ultra™- und radiometrischen Messungen auf der Platte belassen werden. TopSeal-Plattenversiegelungen haben spektrale Eigenschaften, die mit anderen Arten von Assay-Messungen (Absorptionsassays, kolorimetrische Assays, Fluoreszenzassays) interferieren können. Für diese Arten von Assays sollten Sie die Plattenmessung mit und ohne TopSeal-Plattenverschluss vergleichen, um auf Interferenzen zu testen. BackSeal-Plattenversiegelungen sind Plattenversiegelungen, die auf dem Boden der Platte angebracht werden. BackSeal-Plattensiegel können verwendet werden, um den Boden einer Filterplatte vor der Zugabe des Szintillationscocktails abzudichten und so ein Auslaufen zu verhindern. BackSeal-Plattendichtungen können auch verwendet werden, um eine Platte mit klarem Boden in eine Platte mit weißem oder schwarzem Boden zu verwandeln, um das Übersprechen bei Messungen von oben zu reduzieren.

Plattendichtungsprodukte
Produkt
Art der Dichtung
Platte Format
Anzahl der Siegel
Katalognummer
TopSeal-A Klarer Klebesiegel Alle 100 6050185
Klarer Klebesiegel, für 24-Well-Platten 24-Well 100 6005189
Schwarzes Klebesiegel Alle 100 6050173
TopSeal-B Dichtungen für PCR-Platten Alle 100 6050174
TopSeal-S Wärmedichtung für Polystyrolplatten 96-well 100 6050192
BackSeal Weiße Klebedichtung 96-, 384-well 55 6005199
Schwarze Klebedichtung 96-, 384-well 55 6005189

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Kundenspezifische Plattendienste bei PerkinElmer

PerkinElmer bietet kundenspezifische Mikroplatten an, einschließlich:

  • Bestellen von Großmengen
  • Schnelle und flexible Barcodierung von Platten
  • Biologische Plattenbeschichtung einschließlich – Poly-D-Lysin, Kollagen, Streptavidin und Antikörperbeschichtung
  • Behandlungen nach Kundenwunsch einschließlich – Gewebekultur, hohe Proteinbindung und niedrige Proteinbindung
  • Kundensterilisation

PerkinElmer bietet auch Spezialverpackungen und andere Mikroplattenbeschichtungen und -behandlungen an. Wenn Sie an kundenspezifischen Platten interessiert sind, wenden Sie sich bitte an unsere kundenspezifischen Serviceteams: OnPointSM Dienstleistungen für kundenspezifische Mikroplatten

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