top

Overview

Les essais d’absorbance et colorimétriques sont conçus pour détecter ou quantifier la quantité d’un réactif particulier dans un essai en mesurant la quantité de lumière absorbée par le réactif ou le produit de réaction chromogène à une longueur d’onde caractéristique. Cette longueur d’onde est spécifique au réactif mesuré. Plus la quantité de réactif présente dans le puits est importante, plus la lumière sera absorbée. De nombreux essais colorimétriques utilisent un substrat « chromogène » (produisant de la couleur) qui, lorsqu’il est converti en son produit final, absorbe la lumière à une longueur d’onde spécifique.

Les exemples de tests d’absorbance comprennent les ELISA colorimétriques (tels que le kit p24 d’Alliance), l’ELAST ELISA, les tests qui utilisent des substrats chromogènes (tels que BCIP, DAB, 4CN et Fast Red), les tests de Bradford, les tests conçus pour quantifier sur la base du coefficient d’extinction molaire d’une substance, et d’autres tests d’absorbance et colorimétriques.

Dosage ELISA colorimétrique
Exemple de dosage ELISA colorimétrique.

Haut

Considérations relatives aux plaques

Longueur d’onde de l’absorbance et propriétés spectrales des plaques

Les essais qui mesurent l’absorbance dans la gamme de la lumière visible (longueurs d’onde de 400 à 900 nm) peuvent être réalisés dans des plaques en polystyrène à fond transparent. Les essais qui mesurent l’absorbance dans la gamme des ultraviolets (longueurs d’onde de 200-400 nm) nécessiteront des plaques faites d’un matériau transparent aux UV (comme le verre ou les copolymères d’oléfines cycliques), pour éviter l’absorption de la lumière par le plastique lui-même.

Signal

La plupart des essais d’absorbance (colorimétriques) sont réalisés dans des plaques transparentes, comme les microplaques SpectraPlate™. En effet, la couleur claire du plastique ne doit pas interférer avec les mesures dans le domaine de la lumière visible (longueurs d’onde de 400 à 900 nm). Le plastique polystyrène transparent ne doit pas absorber la lumière dans le domaine visible.

Discussion croisée

La diaphonie croisée se produit lorsque l’absorption d’un puits voisin interfère avec la mesure du puits d’intérêt, et peut parfois être problématique dans les formats de densité de plaque plus élevés (384 puits, 1536 puits). L’utilisation de plaques à fond transparent qui ont des parois de puits blanches (comme les microplaques IsoPlate™ et ViewPlate®) peut être utile lorsque la diaphonie est un problème.

Top

Microplaques pour les essais d’absorbance à base de cellules

Choisir la bonne microplaque pour un essai à base de cellules dépendra à la fois de la lignée cellulaire spécifique utilisée dans l’essai et du protocole d’essai lui-même. Les questions auxquelles il faut répondre pour choisir la plaque comprennent :

  1. Ai-je besoin d’une plaque stérile, traitée pour la culture de tissus ?
  2. La plaque doit-elle être enduite ?
  3. La plaque doit-elle avoir un fond transparent ou opaque ?

Considérations relatives à la plaque
La nécessité ou non d’utiliser une plaque stérile, traitée pour la culture de tissus, dépend de la durée pendant laquelle les cellules vont rester dans la plaque de dosage. Dans certains tests, les cellules sont ajoutées à la microplaque et le test est terminé en quelques minutes à quelques heures. Dans d’autres cas, les cellules sont cultivées dans des plaques pendant au moins une nuit avant de réaliser le test, ou sont traitées avec des composés pendant des périodes prolongées. En règle générale, si l’essai doit être réalisé en une seule journée de travail, il n’est pas nécessaire d’utiliser une plaque stérile traitée pour la culture de tissus. Si les cellules doivent rester dans la plaque toute une nuit ou plus, une plaque stérile et traitée pour la culture tissulaire doit être utilisée, et des techniques aseptiques doivent être suivies.

La nécessité de plaques traitées pour la culture tissulaire ou enduites dépend des lignées cellulaires spécifiques utilisées, et de la façon dont les cellules vont être traitées au cours de l’essai. Les cellules peuvent être largement divisées en trois classes de cellules :

  1. Cellules fortement adhérentes
  2. Cellules faiblement adhérentes
  3. Cellules en suspension ou non adhérentes

Nos microplaques stériles sont toutes traitées par culture tissulaire pour favoriser la fixation et la croissance des cellules. Le processus de traitement de la culture tissulaire consiste à exposer une microplaque de polystyrène à un gaz plasma afin de modifier la surface hydrophobe du plastique pour la rendre plus hydrophile. La surface résultante porte une charge négative nette en raison de la présence de groupes fonctionnels contenant de l’oxygène, tels que les groupes hydroxyle et carboxyle. Les cellules fortement adhérentes se fixent généralement de manière satisfaisante sur les plaques traitées pour la culture de tissus. Les lignées cellulaires qui adhèrent moins bien peuvent nécessiter une plaque avec un revêtement tel que la poly-D-lysine ou le collagène qui favorise l’attachement mieux que le simple traitement par culture tissulaire. Les essais cellulaires utilisant des cellules en suspension sont généralement réalisés dans des plaques standard traitées pour culture tissulaire. Les plaques enduites ne sont généralement pas utilisées avec des cellules en suspension.

En plus de la lignée cellulaire spécifique utilisée dans l’essai, le protocole d’essai lui-même est important pour décider du type de plaque à utiliser. Par exemple, les essais utilisant des cellules adhérentes peuvent inclure des changements de milieu de culture ou des étapes de lavage dans le protocole. Dans de tels cas, il peut être conseillé d’utiliser une plaque revêtue pour l’essai afin d’empêcher les cellules de se détacher de la plaque pendant l’essai.

Voir les informations supplémentaires sur les traitements et les revêtements des plaques.

Fond clair vs. Plaques opaques
Les microplaques à fond transparent peuvent être utiles pour les essais basés sur les cellules car elles permettent la visualisation microscopique des cellules pour surveiller la confluence, la morphologie et d’autres paramètres qui peuvent affecter la réponse cellulaire dans l’essai. En outre, les essais qui sont configurés pour la lecture du fond nécessitent des plaques à fond clair.

Les plaques à fond clair peuvent être converties en plaques fonctionnellement opaques par l’application d’un BackSeal. Les BackSeals sont disponibles en blanc ou en noir (référence catalogue 6005199 pour le blanc, référence catalogue 6005189 pour le noir). La couleur du BackSeal doit correspondre à la couleur des côtés des puits de la plaque.

Microplaques transparentes SpectraPlate™ TC
Les microplaques SpectraPlate ne sont pas toutes stériles/traitées pour la culture de tissus. Recherchez les produits SpectraPlate désignés par la mention  » TC  » (tissue culture-treated) pour les essais cellulaires utilisant des cellules adhérentes ou en suspension. Les microplaques SpectraPlate sont complètement transparentes et sans couleur. La base à fond transparent permet une visualisation microscopique, ce qui peut être utile lorsqu’une observation microscopique est nécessaire pour vérifier la densité et la morphologie des cellules. Le fond transparent de la plaque permet également d’effectuer des mesures par le haut ou par le bas. Ces plaques sont proposées au format 96 puits et 384 puits.

Tableau de sélection pour les essais d’absorbance et de colorimétrie à base de cellules
Plaque
Description
SpectraPlate™
  • Offertes en culture tissulaire-….traités
  • Plaque transparente
  • Lecteurs de plaques à lecture par le haut ou par le bas
  • Offerts en 96 puits, 384 puits et 1536 puits

Conseils et FAQS

Q. Quel type de couvercles puis-je utiliser pour mes assiettes ?
A. Les SpectraPlates traitées par TC, ainsi que toutes les microplaques traitées par TC de PerkinElmer, sont fournies avec un couvercle. L’exception à cette règle est lorsque la plaque traitée par TC-culture est achetée dans une caisse de 200. Dans ce cas, les couvercles ne sont pas fournis avec les microplaques et doivent être achetés séparément. Pour les plaques à 96 puits, le numéro de catalogue du couvercle est 6005619, et pour les plaques à 384 puits et 1536 puits, le numéro de catalogue du couvercle est 6007619. Les couvercles des plaques à 96 puits ont des anneaux de condensation qui s’alignent sur les puits sous-jacents. Ces couvercles laissent un petit espace entre le couvercle et le puits. Cet espace est nécessaire pour que les cellules puissent  » respirer  » pendant leur croissance. Les couvercles doivent être retirés avant de lire la plaque pour éviter d’endommager le lecteur de plaques.

Q. Puis-je utiliser un joint sur mes plaques, ou cela va-t-il tuer mes cellules ?
A. Si la viabilité des cellules n’est plus un problème, le joint de plaque adhésif TopSeal-A™, numéro de catalogue 6050185, peut être utilisé pour empêcher l’évaporation pendant les étapes d’incubation. Le plastique du joint adhésif TopSeal-A présente certaines propriétés spectrales qui peuvent interférer avec les essais réalisés à des longueurs d’onde d’absorption. Il peut être nécessaire de retirer le joint de la plaque avant la lecture. Si la viabilité cellulaire est un problème au moment où un scellé est nécessaire, nous recommandons d’utiliser des couvercles de plaque stériles (si des pratiques stériles doivent être maintenues) ou un scellé de plaque respirant (si des antibiotiques/antifongiques peuvent être ajoutés au milieu de culture pour éviter la contamination). Les joints de plaque respirants sont disponibles auprès de divers fournisseurs, notamment Nunc® et Corning®.

Haut

Microplaques pour les essais d’absorbance biochimiques

Microplaques pour les essais d’absorbance/colorimétrie standard, in vitro, qui ne nécessitent pas l’ancrage de cellules ou d’autres réactifs à la surface de la plaque.

Microplaques SpectraPlate
Les plaques SpectraPlate sont complètement transparentes. La base à fond transparent permet des mesures à lecture par le haut ou par le bas. Ces plaques sont proposées dans les formats 96 puits, 384 puits (standard ou peu profond) et 1536 puits.

Microplaques ViewPlate™ et IsoPlate™
Dans les cas où la diaphonie peut être un problème (en particulier dans les formats 384 puits ou 1536 puits de plus haute densité), les microplaques ViewPlate ou IsoPlate avec des côtés à parois blanches peuvent être testées. Ces plaques sont proposées avec une base à fond transparent, les côtés de chaque puits étant de couleur blanche (ou noire) unie.

Tableau de sélection absorbance biochimique et dosage colorimétrique

.

Plate
Description
SpectraPlate™
  • Plaque transparente
  • Lecteurs de plaques à lecture par le haut. ou des lecteurs de plaques à lecture par le haut ou par le bas
  • Disponible en 96 puits, 384 puits, et 1536 puits
ViewPlate™
  • Plaque à fond clair et côtés blancs
  • Peut être testée pour réduire la diaphonie lors de l’utilisation des formats 384-puits et 1536 puits
  • Pour les lecteurs de plaques à lecture par le bas (si vous utilisez un instrument à lecture par le haut, il est recommandé d’ajouter un BackSeal)
  • Disponible en 96 puits, 384 puits, et 1536 puits
IsoPlate™
  • Plaque à fond transparent avec côtés blancs
  • Pour les lecteurs de plaques à lecture par le bas (si vous utilisez un instrument à lecture par le haut, il est recommandé d’ajouter un BackSeal).(si vous utilisez un instrument à lecture par le haut, il est recommandé d’ajouter un BackSeal)
  • Disponible en format 96 puits uniquement

Les microplaques IsoPlate à fond transparent sont similaires aux microplaques ViewPlate dans la mesure où le fond de la plaque est transparent, tandis que les côtés de chaque puits sont soit noirs, soit blancs. La microplaque IsoPlate convient donc aux instruments à lecture par le fond. Toutefois, il existe quelques différences entre les microplaques IsoPlate et ViewPlate. Les plaques IsoPlate sont fabriquées en moulant d’abord 96 puits transparents à la fois, puis en moulant un cadre noir ou blanc autour des puits transparents. Ainsi, le puits de couleur blanche ou noire s’étend à la même profondeur que la base du puits transparent, ce qui peut contribuer à réduire la diaphonie dans les essais à lecture par le fond. Les IsoPlates ont été développés à l’origine pour le comptage par coïncidence dans un instrument de détection radiométrique MicroBeta® (lecture du haut et du bas de manière coïncidente). Bien qu’elles aient un fond transparent, les IsoPlates ne sont pas idéales pour l’imagerie confocale (observations microscopiques) car la clarté optique du fond n’est pas aussi bonne que celle des microplaques CellCarrier™ Ultra ou ViewPlate.

Conseils et FAQS

Q. Quel type de joint de plaque puis-je utiliser pour mes plaques ?
A. Le joint de plaque adhésif TopSeal-A, numéro de catalogue 6050185, peut être utilisé pour empêcher l’évaporation pendant les étapes d’incubation. Le plastique du joint adhésif TopSeal-A présente certaines propriétés spectrales qui peuvent interférer avec les essais réalisés à certaines longueurs d’onde d’absorption. Il peut être nécessaire de retirer le sceau de la plaque avant la lecture.

Q. Quel type de couvercles puis-je utiliser pour mes plaques ?
A. Des couvercles transparents non stériles adaptés à nos microplaques SpectraPlate et ViewPlate peuvent être commandés séparément (numéro de catalogue 6005617 pour les plaques à 96 puits, numéro de catalogue 6007617 pour les plaques à 384 puits ou 1536 puits). Ces couvercles laissent un petit espace entre le couvercle et le puits, ce qui peut entraîner une évaporation sur de longues périodes. Les couvercles doivent être retirés avant la lecture de la plaque pour éviter d’endommager le lecteur de plaques.

Haut

Microplaques pour les essais en plaques revêtues (y compris les ELISA colorimétriques)

Parfois appelés « essais en phase solide », les essais en plaques revêtues nécessitent l’ancrage d’un des composants de l’essai (protéine, anticorps, échantillon, etc.) à la surface de la microplaque. Les essais sur plaque enduite utilisent des étapes de lavage pour séparer les réactifs liés (s’associant) et non liés (ne s’associant pas) du puits de la plaque.

Microplaques SpectraPlate HB
Les microplaques SpectraPlate à forte liaison sont des plaques non enduites qui sont spécialement traitées pour permettre l’enrobage passif et direct d’anticorps, de protéines, d’échantillons et d’autres biomolécules en utilisant des procédures d’enrobage de plaques standard. Ces plaques sont complètement transparentes. La base à fond transparent permet des mesures par le haut ou par le bas. Ces plaques sont proposées au format 96 puits et 384 puits.

Tableau de sélection pour les essais colorimétriques sur plaques enduites
Plaque
Description
SpectraPlate™ HB
  • Traitement à haute-traitement de liaison pour les protocoles d’enduction directe sur plaque
  • Plaque transparente
  • Lecteurs de plaques à lecture par le haut ou par le bas
  • Disponible en formats 96 puits et 384 puits

Tips et FAQS

Q. Quel type de scellé pour plaques puis-je utiliser pour mes plaques ?
A. Le joint de plaque adhésif TopSeal-A, numéro de catalogue 6050185, peut être utilisé pour empêcher l’évaporation pendant les étapes d’incubation. Le plastique du joint adhésif TopSeal-A présente certaines propriétés spectrales qui peuvent interférer avec les analyses réalisées à certaines longueurs d’onde d’absorption. Il peut être nécessaire de retirer le sceau de la plaque avant la lecture.

Q. Quel type de couvercles puis-je utiliser pour mes plaques ?
A. Des couvercles transparents non stériles adaptés à nos microplaques SpectraPlate peuvent être commandés séparément (numéro de catalogue 6005617 pour les plaques à 96 puits, numéro de catalogue 6007617 pour les plaques à 384 puits). Ces couvercles laissent un petit espace entre le couvercle et le puits, ce qui peut entraîner une évaporation au fil du temps. Les couvercles doivent être retirés avant de lire la plaque pour éviter d’endommager le lecteur de plaques.

Q. Avez-vous des suggestions de protocoles de revêtement de plaque que je peux utiliser pour lier mon anticorps/échantillon à la plaque ?
A. Les plaques à forte liaison peuvent être enduites à l’aide de toute méthode standard d’enduction de plaques. Les plaques peuvent être enduites de manière passive en utilisant le schéma de base ci-dessous :

  1. L’anticorps, la protéine ou l’échantillon (concentration de ~10 µg/mL ou plus) est incubé dans la plaque pendant une nuit dans un tampon carbonate à une température appropriée (température ambiante ou 4 °C). Choisir une température qui aidera à maintenir la stabilité de l’anticorps, de la protéine ou de l’échantillon enrobé.
  2. La plaque est lavée trois fois avec un tampon (par exemple, PBS 1X).
  3. La plaque est « bloquée » pendant la nuit pour couvrir la surface du puits qui reste (en utilisant généralement de la BSA, des sucres tels que le tréhalose ou la caséine, du sérum, etc.)
  4. Des lavages finaux sont effectués avec un tampon avant d’utiliser la plaque dans un essai.

Pour plus d’informations sur l’enrobage, le blocage et le stockage des plaques, nous recommandons cette référence :

Brown, M. C. (2011) Microtiter Plate Elisa, in Immunoassays in Agricultural Biotechnology (ed G. Shan), John Wiley & Sons, Inc, Hoboken, NJ, USA. doi : 10.1002/9780470909935.ch4

Top

Sceaux de plaque

PerkinElmer propose une variété de sceaux de plaque. TopSeal™ est une gamme de scellés de plaque qui sont appliqués sur la surface supérieure de la plaque, et sont utilisés pour empêcher l’évaporation ou la contamination radioactive pendant les étapes d’incubation du dosage et/ou les mesures de lecture de la plaque. TopSeal-A peut être laissé sur la plaque pendant les mesures de luminescence, AlphaScreen®, AlphaLISA®, AlphaLISA®SureFire® Ultra™ et radiométriques. Les joints de plaque TopSeal ont des propriétés spectrales qui peuvent interférer avec d’autres types de mesures de test (tests d’absorbance, tests colorimétriques, tests de fluorescence). Pour ces types de tests, vous devez comparer la mesure de la plaque avec et sans scellé TopSeal pour vérifier l’absence d’interférence. Les scellés de plaque BackSeal sont des scellés de plaque qui sont appliqués sur le fond de la plaque. Les scellés BackSeal peuvent être utilisés pour sceller le fond d’une plaque de filtration avant l’ajout du cocktail de scintillation, afin d’éviter les fuites. Les joints de plaque BackSeal peuvent également être utilisés pour changer une plaque à fond transparent en une plaque à fond blanc ou noir afin de réduire la diaphonie pendant les mesures à lecture par le haut.

Produits de scellement de plaques
Produit
Type de scellement
Plaque. Format
Nombre de scellés
Numéro de catalogue
TopSeal-A Sceau adhésif transparent Tous 100 6050185
Sceau adhésif transparent, pour plaques 24 puits 24 puits 100 6005189
Sceau adhésif noir Tout 100 6050173
TopSeal-B Sceau adhésif pour plaques PCR Tous 100 6050174
TopSeal-S Scellé thermique pour plaques de polystyrène 96-puits 100 6050192
BackSeal Scellé adhésif blanc 96-, 384-puits 55 6005199
Sceau adhésif noir 96-, 384 puits 55 6005189

Top

Services de plaques personnalisées chez PerkinElmer

PerkinElmer offre des services de microplaques personnalisées, notamment :

  • Commande en vrac
  • Codage à barres des plaques rapide et flexible
  • Enrobage de plaques biologiques, notamment – poly-D-lysine, collagène, streptavidine et enrobage d’anticorps
  • Traitements personnalisés, notamment – culture de tissus, liaison à haute teneur en protéines et liaison à faible teneur en protéines
  • Stérilisation sur mesure

PerkinElmer propose également des emballages spéciaux et d’autres revêtements et traitements de microplaques. Si vous êtes intéressé par les services de plaques personnalisées, veuillez contacter nos équipes de services personnalisés : Services de microplaques personnalisées OnPointSM

Top

Laisser un commentaire

Votre adresse e-mail ne sera pas publiée.