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Panoramica

I saggi colorimetrici e di assorbanza sono progettati per rilevare o quantificare la quantità di un particolare reagente in un saggio misurando la quantità di luce assorbita dal reagente o dal prodotto di reazione cromogenica ad una lunghezza d’onda caratteristica. Questa lunghezza d’onda è specifica per il reagente da misurare. Maggiore è la quantità di reagente presente nel pozzetto, maggiore sarà la luce assorbita. Molti saggi colorimetrici utilizzano un substrato “cromogenico” (che produce colore) che, quando viene convertito nel suo prodotto finale, assorbirà la luce ad una specifica lunghezza d’onda.

Esempi di saggi di assorbanza includono ELISA colorimetrici (come il kit Alliance p24), ELISA ELAST, saggi che utilizzano substrati cromogenici (come BCIP, DAB, 4CN, e Fast Red), saggi Bradford, saggi progettati per quantificare in base al coefficiente di estinzione molare di una sostanza, e altri saggi di assorbanza e colorimetrici.

Saggio ELISA colorimetrico
Esempio di un saggio ELISA colorimetrico.

Sopra

Considerazioni sulla piastra

Lunghezza d’onda dell’assorbanza e proprietà spettrali della piastra

I test che misurano l’assorbanza nella gamma della luce visibile (lunghezza d’onda 400-900 nm) possono essere eseguiti in piastre di polistirene a fondo trasparente. I saggi che misurano l’assorbanza nella gamma ultravioletta (lunghezze d’onda di 200-400 nm) richiederanno piastre fatte di un materiale trasparente ai raggi UV (come il vetro o i copolimeri di olefine cicliche), per evitare l’assorbimento della luce da parte della plastica stessa.

Segnale

La maggior parte dei saggi di assorbanza (colorimetrici) vengono eseguiti in piastre chiare, come le micropiastre SpectraPlate™. Questo perché il colore chiaro della plastica non dovrebbe interferire con le misurazioni nella gamma della luce visibile (lunghezze d’onda 400-900 nm). La plastica trasparente del polistirene non dovrebbe assorbire la luce nella gamma visibile.

Cross-talk

Cross-talk si verifica quando l’assorbimento da un pozzetto vicino interferisce con la misurazione del pozzetto di interesse, e a volte può essere problematico nei formati di densità della piastra più alti (384 pozzetti, 1536 pozzetti). L’uso di piastre dal fondo trasparente con pareti bianche (come le micropiastre IsoPlate™ e ViewPlate®) può essere utile quando il cross-talk è un problema.

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Micropiastre per saggi di assorbanza basati su cellule

La scelta della micropiastra corretta per un saggio basato su cellule dipende sia dalla linea cellulare specifica utilizzata nel saggio sia dal protocollo del saggio stesso. Le domande a cui bisogna rispondere nella scelta della piastra includono:

  1. Ho bisogno di una piastra sterile, trattata per la cultura dei tessuti?
  2. La piastra deve essere rivestita?
  3. La piastra deve avere un fondo chiaro o opaco?

Considerazioni sulla piastra
Se sia necessario o meno usare una piastra sterile, trattata per la coltura dei tessuti, dipende dalla durata della permanenza delle cellule nella piastra del test. In alcuni saggi le cellule vengono aggiunte alla micropiastra e il saggio viene completato in pochi minuti o poche ore. In altri casi le cellule sono coltivate in piastre almeno una notte prima di eseguire il test, o sono trattate con composti per lunghi periodi di tempo. Come raccomandazione generale, se il test deve essere eseguito entro un solo giorno lavorativo una piastra sterile e trattata con coltura di tessuti non è necessaria. Se le cellule stanno per essere nella piastra durante la notte o più a lungo una sterile, piastra trattata con coltura di tessuti dovrebbe essere utilizzato, e tecniche asettiche dovrebbero essere seguite.

La necessità di piastre trattate con coltura di tessuti o rivestite dipende dalle linee cellulari specifiche utilizzate, e come le cellule stanno per essere trattati nel corso del test. Le cellule possono essere ampiamente divise in tre classi di cellule:

  1. Cellule fortemente aderenti
  2. Cellule scarsamente aderenti
  3. Cellule in sospensione o non aderenti

Le nostre micropiastre sterili sono tutte trattate con la coltura dei tessuti per promuovere il fissaggio e la crescita delle cellule. Il processo di trattamento delle colture tissutali comporta l’esposizione di una micropiastra di polistirene a un gas plasma al fine di modificare la superficie plastica idrofoba per renderla più idrofila. La superficie risultante ha una carica negativa netta dovuta alla presenza di gruppi funzionali contenenti ossigeno come l’idrossile e il carbossile. Le cellule fortemente aderenti di solito si attaccano in modo soddisfacente alle piastre trattate per la coltura dei tessuti. Le linee cellulari che attaccano meno fortemente possono richiedere una piastra con un rivestimento come la poli-D-lisina o il collagene che promuove l’attaccamento meglio del semplice trattamento con la coltura dei tessuti. I saggi basati sulle cellule che utilizzano cellule in sospensione vengono generalmente eseguiti in piastre standard trattate con coltura di tessuti. Piastre rivestite non sono tipicamente utilizzate con cellule in sospensione.

Oltre alla linea cellulare specifica utilizzata nel test, il protocollo stesso del test è importante per decidere il tipo di piastra da utilizzare. Per esempio, i saggi che utilizzano cellule aderenti possono includere cambi di terreno di coltura o fasi di lavaggio nel protocollo. In questi casi può essere consigliabile utilizzare una piastra rivestita per il test al fine di evitare che le cellule si stacchino dalla piastra durante il test.

Vedi ulteriori informazioni sui trattamenti e rivestimenti delle piastre.

Fondo chiaro vs. Piastre opache
Le micropiastre con il fondo trasparente possono essere utili per i saggi basati sulle cellule in quanto permettono la visualizzazione microscopica delle cellule per monitorare la confluenza, la morfologia e altri parametri che possono influenzare la risposta cellulare nel saggio. Inoltre, i saggi che sono configurati per la lettura del fondo richiedono piastre a fondo chiaro.

Le piastre a fondo chiaro possono essere convertite in piastre funzionalmente opache mediante l’applicazione di un BackSeal. Le BackSeal sono disponibili in bianco o in nero (numero di catalogo 6005199 per il bianco, numero di catalogo 6005189 per il nero). Il colore del BackSeal dovrebbe corrispondere al colore dei lati dei pozzetti della piastra.

Micropiastre trasparenti SpectraPlate™ TC
Non tutte le micropiastre SpectraPlate sono sterili/trattate per la coltura dei tessuti. Cerca i prodotti SpectraPlate che sono designati come “TC” (trattati per la coltura dei tessuti) per saggi basati su cellule che utilizzano cellule aderenti o in sospensione. Le micropiastre SpectraPlate sono completamente trasparenti e non hanno colore. La base dal fondo trasparente permette la visualizzazione al microscopio, che può essere utile quando è richiesta l’osservazione al microscopio per controllare la densità e la morfologia delle cellule. La base trasparente del fondo della piastra permette anche di effettuare misurazioni dall’alto o dal basso. Queste piastre sono offerte in entrambi i formati da 96 e 384 pozzetti.

Tabella di selezione per test colorimetrici e di assorbanza basati su cellule
Piastra
Descrizione
SpectraPlate™
  • Offerta in coltura di tessutitrattati
  • Piastra trasparente
  • Lettori di piastre a lettura dall’alto o dal basso
  • Offerta in 96 pozzetti, 384 e 1536 pozzetti

Consigli e FAQS

Q. Che tipo di coperchi posso usare per i miei piatti?
A. Le SpectraPlate trattate con TC, così come tutte le micropiastre trattate con TC di PerkinElmer, sono fornite con un coperchio. L’eccezione è quando la piastra trattata con TC viene acquistata in una scatola da 200 pezzi. In questo caso, i coperchi non vengono forniti con le micropiastre e devono essere acquistati separatamente. Per le piastre a 96 pozzetti, il numero di catalogo per il coperchio è 6005619, e per le piastre a 384 e 1536 pozzetti il numero di catalogo per il coperchio è 6007619. I coperchi per le piastre a 96 pozzetti hanno anelli di condensazione che si allineano con i pozzetti sottostanti. Questi coperchi lasciano un piccolo spazio tra il coperchio e il pozzetto. Questo è necessario affinché le cellule possano “respirare” durante la crescita. I coperchi devono essere rimossi prima di leggere la piastra per evitare danni al lettore di piastre.

Q. Posso usare un sigillo sulle mie piastre, o questo ucciderà le mie cellule? Se la vitalità delle cellule non è più un problema, il sigillo adesivo per piastre TopSeal-A™, numero di catalogo 6050185, può essere usato per prevenire l’evaporazione durante le fasi di incubazione. La plastica del sigillo adesivo TopSeal-A ha alcune proprietà spettrali che possono interferire con i saggi eseguiti a lunghezze d’onda di assorbimento. Potrebbe essere necessario rimuovere il sigillo dalla piastra prima della lettura. Se la vitalità delle cellule è un problema nel momento in cui è necessario un sigillo, si consiglia di utilizzare coperchi per piastre sterili (se le pratiche sterili devono essere mantenute) o sigilli per piastre traspiranti (se gli antibiotici/antifunghi possono essere aggiunti ai mezzi di coltura per prevenire la contaminazione). I sigilli per piastre traspiranti sono disponibili da vari fornitori, tra cui Nunc® e Corning®.

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Micropiastre per saggi biochimici di assorbanza

Micropiastre per saggi standard di assorbanza/colorimetrici in vitro che non richiedono l’ancoraggio di cellule o altri reagenti alla superficie della piastra.

Micropiastre SpectraPlate
Le piastre SpectraPlate sono completamente trasparenti. La base con fondo trasparente permette di effettuare misurazioni con lettura dall’alto o dal basso. Queste piastre sono offerte nei formati a 96 pozzetti, 384 pozzetti (standard o poco profondi) e 1536 pozzetti.

MicropiastreViewPlate™ e IsoPlate™
Nei casi in cui il cross-talk può essere un problema (in particolare nei formati a più alta densità a 384 o 1536 pozzetti), possono essere testate le micropiastre ViewPlate o IsoPlate con pareti bianche. Queste piastre sono offerte con una base dal fondo trasparente, con i lati di ogni pozzetto di colore bianco solido (o nero).

Tabella di selezione assorbanza biochimica e saggio colorimetrico
Plate
Descrizione
SpectraPlate™
  • Piastra trasparente
  • Lettori di piastre a lettura dall’alto Lettori di piastre a lettura dall’alto o dal basso
  • Forniti in 96 pozzetti, 384 pozzetti, e 1536 pozzetti
ViewPlate™
  • Piastra dal fondo chiaro con lati bianchi
  • Può essere testata per ridurre il cross-talk quando si usano formati a 384e 1536 pozzetti
  • Per lettori di piastre a lettura dal basso (se si usa uno strumento a lettura dall’alto si raccomanda di aggiungere un BackSeal)
  • Offerta in 96 pozzetti, 384 pozzetti, e 1536 pozzetti
IsoPlate™
  • Piastra a fondo chiaro con lati bianchi
  • Per lettori di piastre a lettura dal basso (se si usa uno strumento a lettura dall’alto(se si utilizza uno strumento di lettura dall’alto si raccomanda di aggiungere un BackSeal)
  • Fornita solo nel formato a 96 pozzetti

Le micropiastre IsoPlate a fondo chiaro sono simili alle micropiastre ViewPlate in quanto il fondo della piastra è chiaro, mentre i lati di ogni pozzetto sono neri o bianchi. Questo rende la micropiastra IsoPlate adatta agli strumenti di lettura del fondo. Tuttavia, ci sono alcune differenze tra le micropiastre IsoPlate e ViewPlate. Le IsoPlate sono prodotte modellando prima 96 pozzetti trasparenti alla volta, poi modellando una cornice nera o bianca intorno ai pozzetti trasparenti. Questo fa sì che il pozzetto bianco o nero si estenda alla stessa profondità della base del pozzetto trasparente e può aiutare a ridurre il cross-talk nei saggi di lettura del fondo. Gli IsoPlates sono stati originariamente sviluppati per il conteggio di coincidenza in uno strumento di rilevamento radiometrico MicroBeta® (lettura dall’alto e dal basso in modo coincidente). Anche se hanno un fondo trasparente, gli IsoPlates non sono ideali per l’imaging confocale (osservazioni microscopiche) perché la chiarezza ottica del fondo non è così buona come quella delle micropiastre CellCarrier™ Ultra o ViewPlate.

Suggerimenti e FAQS

Q. Che tipo di sigillo per piastre posso usare per le mie piastre?
A. Il sigillo adesivo per piastre TopSeal-A, numero di catalogo 6050185, può essere usato per prevenire l’evaporazione durante le fasi di incubazione. La plastica del sigillo adesivo TopSeal-A ha alcune proprietà spettrali che possono interferire con i saggi eseguiti a determinate lunghezze d’onda di assorbimento. Potrebbe essere necessario rimuovere il sigillo dalla piastra prima della lettura.

Q. Che tipo di coperchi posso usare per le mie piastre? Coperchi trasparenti, non sterili, che si adattano alle nostre micropiastre SpectraPlate e ViewPlate possono essere ordinati separatamente (numero di catalogo 6005617 per piastre da 96 pozzetti, numero di catalogo 6007617 per piastre da 384 o 1536 pozzetti). Questi coperchi lasciano un piccolo spazio tra il coperchio e il pozzetto, che può portare all’evaporazione per lunghi periodi di tempo. I coperchi devono essere rimossi prima di leggere la piastra per evitare di danneggiare il lettore di piastre.

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Micropiastre per saggi su piastra rivestita (inclusi gli ELISA colorimetrici)

A volte indicati come “saggi in fase solida”, i saggi su piastra rivestita richiedono l’ancoraggio di uno dei componenti del saggio (proteine, anticorpi, campioni, ecc) alla superficie della micropiastra. I saggi su piastra rivestita utilizzano fasi di lavaggio per separare i reagenti legati (che si associano) e non legati (che non si associano) dal pozzetto della piastra.

Micropiastre SpectraPlate HB
Le micropiastre SpectraPlate ad alto legame sono piastre non rivestite che sono appositamente trattate per consentire il rivestimento passivo e diretto di anticorpi, proteine, campioni e altre biomolecole utilizzando procedure standard di rivestimento della piastra. Queste piastre sono completamente trasparenti. La base con fondo trasparente permette di effettuare misurazioni con lettura dall’alto o dal basso. Queste piastre sono offerte nel formato a 96 e 384 pozzetti.

Tabella di selezione per saggi colorimetrici su piastra rivestita
Piastra
Descrizione
SpectraPlate™ HB
  • Trattamento altotrattamento ad alto legame per protocolli di rivestimento diretto delle piastre
  • Piastra trasparente
  • Lettori di piastre a lettura dall’alto o dal basso
  • Offerto nei formati da 96 e 384 pozzetti

Consigli e FAQS

Q. Che tipo di sigillo per lastre posso usare per le mie lastre?
A. Il sigillo adesivo per piastre TopSeal-A, numero di catalogo 6050185, può essere usato per prevenire l’evaporazione durante le fasi di incubazione. La plastica del sigillo adesivo TopSeal-A ha alcune proprietà spettrali che possono interferire con i saggi eseguiti a determinate lunghezze d’onda di assorbimento. Potrebbe essere necessario rimuovere il sigillo dalla piastra prima della lettura.

Q. Che tipo di coperchi posso usare per le mie piastre? I coperchi trasparenti non sterili che si adattano alle nostre micropiastre SpectraPlate possono essere ordinati separatamente (numero di catalogo 6005617 per le piastre da 96 pozzetti, numero di catalogo 6007617 per le piastre da 384 pozzetti). Questi coperchi lasciano un piccolo spazio tra il coperchio e il pozzetto, che può portare all’evaporazione nel tempo. I coperchi devono essere rimossi prima di leggere la piastra per evitare danni al lettore di piastre.

Q. Avete qualche protocollo suggerito per il rivestimento della piastra che posso usare per legare il mio anticorpo/campione alla piastra? Le piastre ad alto legame possono essere rivestite utilizzando qualsiasi metodo standard di rivestimento delle piastre. Le piastre possono essere rivestite passivamente utilizzando il seguente schema di base:

  1. L’anticorpo, la proteina o il campione (concentrazione di ~10 µg/mL o superiore) vengono incubati nella piastra per una notte in un tampone carbonato a una temperatura appropriata (temperatura ambiente o 4 °C). Selezionare una temperatura che aiuterà a mantenere la stabilità dell’anticorpo, della proteina o del campione da rivestire.
  2. La piastra viene lavata tre volte con il tampone (per esempio, 1X PBS).
  3. La piastra viene “bloccata” durante la notte per coprire la superficie del pozzetto che rimane (in genere utilizzando BSA, zuccheri come trealosio o caseina, siero, ecc.)
  4. I lavaggi finali vengono eseguiti con tampone prima di utilizzare la piastra in un test.

Per ulteriori informazioni sul rivestimento della piastra, il blocco e la conservazione, si consiglia questo riferimento:

Brown, M. C. (2011) Microtiter Plate Elisa, in Immunoassays in Agricultural Biotechnology (ed G. Shan), John Wiley & Sons, Inc, Hoboken, NJ, USA. doi: 10.1002/9780470909935.ch4

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Plate seals

PerkinElmer offre una varietà di plate seals. TopSeal™ è una gamma di sigilli per piastre che vengono applicati alla superficie superiore della piastra e sono utilizzati per prevenire l’evaporazione o la contaminazione radioattiva durante le fasi di incubazione del test e/o le misure di lettura della piastra. TopSeal-A può essere lasciato sulla piastra durante le misure di luminescenza, AlphaScreen®, AlphaLISA®, AlphaLISA®SureFire® Ultra™ e le misure radiometriche. I sigilli per piastre TopSeal hanno proprietà spettrali che possono interferire con altri tipi di misurazioni (test di assorbanza, test colorimetrici, test di fluorescenza). Per questi tipi di test, si dovrebbe confrontare la misurazione della piastra con e senza un sigillo per lastre TopSeal per verificare la presenza di interferenze. I sigilli per piastre BackSeal sono sigilli per piastre che vengono applicati sul fondo della piastra. I sigilli per piastre BackSeal possono essere utilizzati per sigillare il fondo di una piastra filtro prima dell’aggiunta del cocktail di scintillazione, prevenendo le perdite. Le guarnizioni della piastra BackSeal possono anche essere usate per cambiare una piastra con fondo chiaro in una piastra con fondo bianco o nero per ridurre il cross-talk durante le misure di lettura dall’alto.

Prodotti di guarnizione per piastre
Prodotto
Tipo di guarnizione
Piastra Formato
Numero di guarnizioni
Numero di catalogo
TopSeal-A Sigillo adesivo trasparente Tutti 100 6050185
Sigillo adesivo trasparente, per piastre da 24 pozzetti 24 pozzetti 100 6005189
Sigillo adesivo nero Tutti 100 6050173
TopSeal-B Sigillo per piastre PCR Tutti 100 6050174
TopSeal-S Sigillo termico per piastre in polistirolo 96 pozzetti 100 6050192
BackSeal Sigillo adesivo bianco 96-, 384-well 55 6005199
Sigillo adesivo nero 96-, 384 pozzetti 55 6005189

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Servizi per piastre personalizzate presso PerkinElmer

PerkinElmer offre servizi di micropiastre personalizzate, inclusi:

  • Ordini in blocco
  • Codifica a barre delle piastre rapida e flessibile
  • Rivestimento di piastre biologiche che include – poli-D-lisina, collagene, streptavidina e rivestimento di anticorpi
  • Trattamenti personalizzati che includono – coltura di tessuti, alto legame proteico e basso legame proteico
  • Sterilizzazione del cliente

PerkinElmer offre anche imballaggi speciali e altri rivestimenti e trattamenti per micropiastre. Se siete interessati a servizi di piastre personalizzate, contattate i nostri team di assistenza personalizzata: Servizi per micropiastre personalizzate OnPointSM

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