top

Översikt

Absorbans- och kolorimetriska analyser är utformade för att detektera eller kvantifiera mängden av en viss reagens i en analys genom att mäta den mängd ljus som absorberas av reagenset eller den kromogena reaktionsprodukten vid en karakteristisk våglängd. Denna våglängd är specifik för den reagens som mäts. Ju större mängd reagens som finns i brunnen, desto mer ljus absorberas. Många kolorimetriska tester använder ett ”kromogent” (färgproducerande) substrat som, när det omvandlas till sin slutprodukt, absorberar ljus vid en specifik våglängd.

Exempel på absorbansanalyser omfattar kolorimetriska ELISA (t.ex. Alliance p24-kit), ELAST ELISA, analyser som använder kromogena substrat (t.ex. BCIP, DAB, 4CN och Fast Red), Bradford-analyser, analyser som är utformade för att kvantifiera på grundval av den molära extinktionskoefficienten för en substans och andra absorbans- och kolorimetriska analyser.

Kolorimetrisk ELISA-analys
Exempel på en kolorimetrisk ELISA-analys.

Top

Plattans överväganden

Absorbansvåglängd och plattans spektrala egenskaper

Assays som mäter absorbans i det synliga ljusområdet (400-900 nm våglängd) kan köras i polystyrenplattor med klar botten. Analyser som mäter absorbans i det ultravioletta området (200-400 nm våglängder) kräver plattor som är tillverkade av ett UV-transparent material (t.ex. glas eller cykliska olefinkopolymerer), för att undvika att ljuset absorberas av själva plasten.

Signal

De flesta absorbansanalyser (kolorimetriska analyser) utförs i genomskinliga plattor, t.ex. SpectraPlate™-mikroplattor. Detta beror på att plastens klara färg inte bör störa mätningar i det synliga ljusområdet (400-900 nm våglängder). Klar polystyrenplast bör inte absorbera ljus i det synliga området.

Korsningstalk

Korsningstalk uppstår när absorption från en angränsande brunn stör mätningen av den intressanta brunnen, och kan ibland vara problematiskt i format med högre plåttäthet (384- eller 1536-brunnar). Användning av plattor med klar botten som har vita brunnsväggar (t.ex. IsoPlate™- och ViewPlate®-mikroplattor) kan vara till hjälp när tvärspridning är ett problem.

Top

Mikroplattor för cellbaserade absorptionsanalyser

Väljning av rätt mikroplatta för en cellbaserad analys kommer att vara beroende av både den specifika cellinje som används i analysen och av själva analysprotokollet. Frågor som måste besvaras vid valet av platta är bland annat:

  1. Behövs det en steril, vävnadskulturbehandlad platta?
  2. Behövs det en beläggning på plattan?
  3. Bör plattan ha en klar eller ogenomskinlig botten?

Plattans överväganden
Om det är nödvändigt att använda en steril, vävnadskulturbehandlad platta eller inte beror på hur länge cellerna kommer att vara i analysplattan. I vissa analyser tillsätts cellerna till mikroplattan och analysen avslutas inom några minuter till några timmar. I andra fall odlas cellerna i plattorna minst över natten innan analysen utförs, eller behandlas med föreningar under längre tid. En allmän rekommendation är att en steril, vävnadskulturbehandlad platta inte är nödvändig om analysen ska utföras under en enda arbetsdag. Om cellerna kommer att vara i plattan över natten eller längre bör en steril, vävnadskulturbehandlad platta användas, och aseptisk teknik bör följas.

Behovet av vävnadskulturbehandlade eller belagda plattor beror på de specifika cellinjer som används och hur cellerna kommer att behandlas under analysen. Celler kan i stort sett delas in i tre klasser av celler:

  1. Stark vidhäftande celler
  2. Svagt vidhäftande celler
  3. Suspension eller icke vidhäftande celler

Våra sterila mikroplattor är alla vävnadskulturbehandlade för att främja cellernas fastsättning och tillväxt. Vävnadskulturbehandlingen innebär att en polystyrenmikroplatta utsätts för en plasmagas för att modifiera den hydrofoba plastytan så att den blir mer hydrofil. Den resulterande ytan har en negativ nettoladdning på grund av förekomsten av syrehaltiga funktionella grupper som hydroxyl och karboxyl. Starkt vidhäftande celler fäster vanligtvis på ett tillfredsställande sätt på vävnadskulturbehandlade plattor. Cellinjer som fäster mindre starkt kan behöva en platta med en beläggning, t.ex. poly-D-lysin eller kollagen, som främjar fästningen bättre än enbart vävnadskulturbehandling. Cellbaserade analyser med suspensionsceller utförs i allmänhet i standardplattor som behandlats med vävnadskultur. Belagda plattor används vanligtvis inte med suspensionsceller.

Förutom den specifika cellinje som används i testet är själva testprotokollet viktigt när det gäller att avgöra vilken typ av platta som ska användas. Till exempel kan analyser som använder adherenta celler innefatta byten av odlingsmedium eller tvättsteg i protokollet. I sådana fall kan det vara tillrådligt att använda en belagd platta för analysen för att förhindra att cellerna lossnar från plattan under analysen.

Se ytterligare information om plattbehandlingar och beläggningar.

Klar botten vs. Opaka plattor
Mikroplattor med klar botten kan vara användbara för cellbaserade analyser eftersom de möjliggör mikroskopisk visualisering av cellerna för att övervaka konfluens, morfologi och andra parametrar som kan påverka det cellulära svaret i analysen. Dessutom kräver assays som är konfigurerade för avläsning av botten tydliga bottenplattor.

Tydliga bottenplattor kan omvandlas till funktionellt ogenomskinliga plattor genom applicering av en BackSeal. BackSeals finns i antingen vit eller svart (katalognummer 6005199 för vit, katalognummer 6005189 för svart). Färgen på BackSeal ska matcha färgen på sidorna av plattans brunnar.

SpectraPlate™ TC clear microplates
Inte alla SpectraPlate-mikroplattor är sterila/vävnadskulturbehandlade. Leta efter SpectraPlate-produkter som är betecknade som ”TC” (vävnadskulturbehandlade) för cellbaserade analyser som använder adherenta eller suspenderade celler. SpectraPlate-mikroplattor är helt genomskinliga och saknar färg. Den klara bottenbasen möjliggör mikroskopisk visualisering, vilket kan vara till hjälp när mikroskopisk observation krävs för att kontrollera celltäthet och morfologi. Plattans genomskinliga bottenbas gör det också möjligt att göra mätningar med avläsning uppifrån eller nedifrån. Dessa plattor erbjuds i både 96- och 384-väggsformat.

Väljartabell för cellbaserade absorbans- och kolorimetriska analyser
Platta
Beskrivning
SpectraPlate™
  • Anbjuds i vävnadskultur-.behandlad
  • Klar platta
  • Top- eller bottom-reading plate readers
  • Erbjuds i 96-well, 384- och 1536-formaten

Tips and FAQS

Q. Vilken typ av lock kan jag använda till mina tallrikar?
A. TC-behandlade SpectraPlates, liksom alla TC-behandlade mikroplattor från PerkinElmer, levereras med ett lock. Undantaget är när den TC-kulturbehandlade plattan köps i en låda om 200 stycken. I detta fall levereras inte locken med mikroplattorna utan måste köpas separat. Katalognumret för locket är 6005619 för 96-väggsplattor och 6007619 för 384-väggsplattor och 1536-väggsplattor. Locken för 96-välliga plattor har kondensringar som ligger i linje med de underliggande brunnarna. Dessa lock lämnar ett litet utrymme mellan locket och brunnen. Detta är nödvändigt för att cellerna ska kunna ”andas” när de växer. Locken bör avlägsnas före avläsning av plattan för att förhindra skador på plattläsaren.

Q. Kan jag använda en tätning på mina plattor, eller kommer det att döda mina celler?
A. Om cellens livskraft inte längre är ett problem kan TopSeal-A™ självhäftande plåttätning, katalognummer 6050185, användas för att förhindra avdunstning under inkubationsstegen. Plasten i den självhäftande TopSeal-A-tätningen har vissa spektrala egenskaper som kan störa analyser som utförs vid absorptionsvåglängder. Det kan vara nödvändigt att ta bort förseglingen från plattan före avläsning. Om cellviabiliteten är ett problem vid den tidpunkt då förseglingen behövs, rekommenderar vi att man använder sterila tallrikslock (om sterila rutiner måste upprätthållas) eller ventilerande tallriksförsegling (om antibiotika/antifungaler kan tillsättas till kulturmediet för att förhindra kontaminering). Andningsbara plattförseglingar finns tillgängliga från olika leverantörer, bland annat Nunc® och Corning®.

Top

Mikroplattor för biokemiska absorbansanalyser

Mikroplattor för standardiserade, in vitro absorbans/kolorimetriska analyser som inte kräver förankring av celler eller andra reagenser på plattans yta.

SpectraPlate-mikroplattor
SpectraPlate-plattor är helt transparenta. Den genomskinliga basen med klar botten gör det möjligt att göra mätningar med avläsning uppifrån eller nedifrån. Dessa plattor erbjuds i format med 96 brunnar, 384 brunnar (standard eller grunda brunnar) och 1536 brunnar.

ViewPlate™- och IsoPlate™-mikroplattor
I de fall där överhörning kan vara ett problem (särskilt i format med högre densitet på 384 brunnar eller 1536 brunnar) kan ViewPlate- eller IsoPlate-mikroplattor med vitväggiga sidor testas. Dessa plattor erbjuds med en bas med klar botten, där sidorna i varje brunn har en solid vit (eller svart) färg.

Väljartabell biokemisk absorbans och kolorimetrisk analys

.

Platta
Beskrivning
SpectraPlate™
  • Klar platta
  • Topp- eller bottenläsande plattläsare
  • Försäljs i 96-väggar, 384-väggar, och 1536-väggsformat
ViewPlate™
  • Tydlig bottenplatta med vita sidor
  • Kan testas för att minska överhörning vid användning av 384-brunns- och 1536-brunnsformat
  • För plattläsare med bottenläsning (om du använder instrument med toppläsning rekommenderas att du lägger till ett BackSeal)
  • Försvaras i 96-brunnsformat, 384-väggar, och 1536-väggsformat
IsoPlate™
  • Klar bottenplatta med vita sidor
  • För plattläsare med bottenavläsning (om du använder en topp-läsande instrument rekommenderas att du lägger till ett BackSeal)
  • Anbjuds endast i 96-väggsformat

IsoPlate-mikroplattor med klar botten liknar ViewPlate-mikroplattor i det avseendet att botten på plattan är klar, medan sidorna på varje brunn är antingen svarta eller vita. Detta gör IsoPlate-mikroplattan lämplig för instrument som läser av botten. Det finns dock några skillnader mellan IsoPlate- och ViewPlate-mikroplattor. IsoPlates tillverkas genom att först gjuta 96 klara brunnar åt gången och sedan gjuta en svart eller vit ram runt de klara brunnarna. Detta gör att den vita eller svartfärgade brunnen sträcker sig till samma djup som den klara brunnsbasen och kan bidra till att minska överhörningen vid analyser med bottenavläsning. IsoPlates utvecklades ursprungligen för att användas för tillfällig räkning i ett MicroBeta® radiometriskt detektionsinstrument (avläsning från toppen och botten samtidigt). Även om de har klara bottnar är IsoPlates inte idealiska för konfokal avbildning (mikroskopiska observationer) eftersom den optiska klarheten i botten inte är lika bra som klarheten är med CellCarrier™ Ultra eller ViewPlate-mikroplattor.

Tips and FAQS

Q. Vilken typ av plåttätning kan jag använda till mina plattor?
A. TopSeal-A adhesiv plattförsegling, katalognummer 6050185, kan användas för att förhindra avdunstning under inkubationsstegen. Plasten i den självhäftande TopSeal-A-tätningen har vissa spektrala egenskaper som kan störa analyser som utförs vid vissa absorptionsvåglängder. Det kan vara nödvändigt att ta bort förseglingen från plattan före avläsning.

Q. Vilken typ av lock kan jag använda till mina plattor?
A. Tydliga, icke-sterila lock som passar våra SpectraPlate- och ViewPlate-mikroplattor kan beställas separat (katalognummer 6005617 för 96-väggsplattor, katalognummer 6007617 för 384-väggsplattor eller 1536-väggsplattor). Dessa lock lämnar ett litet utrymme mellan locket och brunnen, vilket kan leda till avdunstning under längre tidsperioder. Locken bör avlägsnas före avläsning av plattan för att förhindra skador på plattläsaren.

Top

Mikroplattor för belagda plattor (inklusive kolorimetriska ELISAs)

Ofta kallas de ibland för ”fastfasanalyser”, och för belagda plattor krävs det att en av testkomponenterna (protein, antikropp, prov etc.) förankras på mikroplattans yta. I analyser med belagda plattor används tvättsteg för att separera bundna (associerande) och obundna (icke-associerande) reagenser från plattans brunn.

SpectraPlate HB-mikroplattor
SpectraPlate-mikroplattor med hög bindningsförmåga är obelagda plattor som är specialbehandlade för att möjliggöra passiv, direkt beläggning av antikroppar, proteiner, prover och andra biomolekyler med hjälp av standardprocedurer för beläggning av plattor. Dessa plattor är helt genomskinliga. Den genomskinliga bottenbottnen gör det möjligt att göra mätningar med avläsning uppifrån eller nedifrån. Plattorna erbjuds i 96- och 384-våningsformat.

Väljtabell för kolorimetriska analyser med belagda plattor
Platta
Beskrivning
SpectraPlate™ HB
  • Hög-Bindande behandling för protokoll för direktbeläggning av plattor
  • Klar platta
  • Top- eller bottom-reading plate readers
  • Anbjuds i 96-well- och 384-well-format

Tipsen och vanliga frågor och svar

Q. Vilken typ av plåttätning kan jag använda för mina plåtar?
A. TopSeal-A adhesiv plattförsegling, katalognummer 6050185, kan användas för att förhindra avdunstning under inkubationsstegen. Plasten i den självhäftande TopSeal-A-tätningen har vissa spektrala egenskaper som kan störa analyser som utförs vid vissa absorptionsvåglängder. Det kan vara nödvändigt att ta bort förseglingen från plattan före avläsning.

Q. Vilken typ av lock kan jag använda till mina plattor?
A. Tydliga, icke-sterila lock som passar våra SpectraPlate-mikroplattor kan beställas separat (katalognummer 6005617 för 96-väggsplattor, katalognummer 6007617 för 384-väggsplattor). Dessa lock lämnar ett litet utrymme mellan locket och brunnen, vilket kan leda till avdunstning med tiden. Locken bör avlägsnas före avläsning av plattan för att undvika skador på plattläsaren.

Q. Har ni några förslag på protokoll för plattbeläggning som jag kan använda för att binda min antikropp/prov till plattan?
A. Plattor med hög bindningsgrad kan beläggas med vilken standardmetod som helst. Plattor kan beläggas passivt med hjälp av den grundläggande beskrivningen nedan:

  1. Antikropp, protein eller prov (koncentration ~10 µg/mL eller högre) inkuberas i plattan över natten i en karbonatbuffert vid lämplig temperatur (rumstemperatur eller 4 °C). Välj en temperatur som bidrar till att bibehålla stabiliteten hos antikroppen, proteinet eller provet som beläggs.
  2. Plattan tvättas tre gånger med buffert (t.ex. 1X PBS).
  3. Plattan ”blockeras” över natten för att täcka den brunnsytan som återstår (vanligen med hjälp av BSA, sockerarter som trehalos eller kasein, serum osv.)
  4. Den sista tvätten utförs med buffert innan plattan används i en analys.

För mer information om beläggning, blockering och förvaring av plattor rekommenderar vi denna referens:

Brown, M. C. (2011) Microtiter Plate Elisa, in Immunoassays in Agricultural Biotechnology (ed G. Shan), John Wiley & Sons, Inc, Hoboken, NJ, USA. doi: 10.1002/9780470909935.ch4

Top

Plattförseglingar

PerkinElmer erbjuder en mängd olika plattförseglingar. TopSeal™ är ett sortiment av plattförseglingar som appliceras på plattans övre yta och används för att förhindra avdunstning eller radioaktiv kontaminering under inkubationssteg för assays och/eller mätningar av plattläsning. TopSeal-A kan lämnas kvar på plattan under luminescens, AlphaScreen®, AlphaLISA®, AlphaLISA®SureFire® Ultra™ och radiometriska mätningar. TopSeal-plattförseglingar har spektrala egenskaper som kan störa andra typer av analysmätningar (absorbansanalyser, kolorimetriska analyser, fluorescensanalyser). För dessa typer av analyser bör du jämföra plattmätningen med och utan TopSeal-plattförsegling för att testa om det förekommer störningar. BackSeal-plattförseglingar är plattförseglingar som appliceras på plattans botten. BackSeal-plattentätningar kan användas för att försegla botten av en filterplatta innan scintillationscocktail tillsätts, vilket förhindrar läckage. BackSeal-plattentätningar kan också användas för att ändra en platta med klar botten till en platta med vit eller svart botten för att minska överhörningen vid mätningar med toppavläsning.

Plattförseglingsprodukter
Produkt
Typ av försegling
Platta Format
Antal förseglingar
Katalognummer
TopSeal-A Tydlig självhäftande tätning Alla 100 6050185
Tydlig självhäftande tätning, för 24-borrhålsplattor 24-borrhål 100 6005189
Svart självhäftande försegling All 100 6050173
TopSeal-B Tätning för PCR-plattor Alla 100 6050174
TopSeal-S Värmetätning för polystyrenplattor 96-well 100 6050192
BackSeal Vit självhäftande tätning 96-, 384-well 55 6005199
Svart självhäftande tätning 96-, 384-väggar 55 6005189

Top

Specialanpassade plåttjänster hos PerkinElmer

PerkinElmer erbjuder specialanpassade mikroplåttjänster, inklusive:

  • Bulkbeställning
  • Snabb och flexibel streckkodning av plattor
  • Biologisk plattbeläggning inklusive – poly-D-lysin, kollagen, streptavidin och antikroppsbeläggning
  • Anpassade behandlingar inklusive – vävnadskultur, hög proteinbindning och låg proteinbindning
  • Kundsterilisering

PerkinElmer erbjuder även specialförpackningar och andra beläggningar och behandlingar av mikroplattor. Om du är intresserad av specialanpassade plåttjänster kan du kontakta våra specialanpassade serviceteam: OnPointSM Custom Microplates Services

Top

Lämna en kommentar

Din e-postadress kommer inte publiceras.